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細(xì)胞光毒性試驗(yàn)材料與試劑

更新時(shí)間:2023-06-30   點(diǎn)擊次數(shù):630次

細(xì)胞光毒性試驗(yàn)材料與試劑

(一)光源類型

選擇合適的光源必須符合的標(biāo)準(zhǔn)包括:光源發(fā)射的光波長能被受試物吸收(吸收光譜),光的劑量(在一個(gè)合理的暴露時(shí)間內(nèi)能達(dá)到的劑量)能滿足已知光毒性化學(xué)物質(zhì)的檢測。此外的波長和劑量不能有損于試驗(yàn)系統(tǒng),如(紅外區(qū)域)熱量散發(fā)或類似UVB波長的高細(xì)胞毒性的干擾,因此光源要求能夠穩(wěn)定地釋放UVA和可見光波長,推薦使用LUYOR-3450細(xì)胞光毒性輻照儀。

由于的太陽光模擬器都發(fā)射出相當(dāng)數(shù)量的UVB,應(yīng)經(jīng)過適當(dāng)?shù)倪^濾使UVB<0.1J/cm2。透過96孔組織培養(yǎng)板蓋的光強(qiáng)度建議為1.7mW/cm2光強(qiáng)度(即5J/cm2)劑量。

(二)細(xì)胞株

選用永生化小鼠成纖維細(xì)胞系—Balb/c 3T3成纖維細(xì)胞。要求細(xì)胞來源必須是具有公信力的機(jī)構(gòu)且能確保細(xì)胞品質(zhì)穩(wěn)定。

由于細(xì)胞對UVA的敏感性隨傳代數(shù)的增加可能增高,建議用于試驗(yàn)的Balb/c 3T3成纖維細(xì)胞傳代次數(shù)好少于100次。

測試單位若自行培養(yǎng)細(xì)胞株,則須定期檢測細(xì)胞株對UV光的敏感性,并確保無支原體污染。

(三)培養(yǎng)基

采用DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清或小牛血清(10%)、谷氨酰胺(4mmol/L)、抗生素(青霉素和鏈霉素,濃度分別為100IU和100μg/mL),在36.5℃—37.5℃, 5%—7.5%CO2條件下培養(yǎng)。

(四)溶劑的選擇

在測定前,應(yīng)首先評價(jià)受試物的溶解度,以選擇佳溶劑體系。溶劑必須不與受試物發(fā)生化學(xué)反應(yīng),不影響細(xì)胞活性。

能溶于水且濃度達(dá)1000μg/mL的受試物可溶于預(yù)先加溫(37℃)和滅菌的磷酸鹽緩沖液(EBSS或PBS)。水中溶解度有限的受試物(<1000μg/mL)可用二甲基亞砜(DMSO)或乙醇(ETOH)等溶劑溶解。使用DMSO或ETOH作為溶劑時(shí),其終濃度不得超過總體積的1%(v/v),陰性對照組和受試物組溶劑的體積比例應(yīng)相同。

(五)受試物的配制

受試物必須在使用前新鮮配制。建議的化學(xué)物質(zhì)操作和細(xì)胞處理初期都應(yīng)避免受試物在光激活或光降解的光線條件下進(jìn)行。

每次實(shí)驗(yàn)應(yīng)設(shè)空白對照、溶劑對照和陽性對照。

(六)受試物劑量的設(shè)置

需通過預(yù)實(shí)驗(yàn)確定有光照和無光照條件下受試物的濃度范圍。用溶劑將受試物原液使用同一常數(shù)稀釋因子(如 =3.16)稀釋成8個(gè)濃度,相關(guān)濃度范圍應(yīng)包括從大細(xì)胞毒性至幾乎無細(xì)胞毒性濃度(細(xì)胞存活率在20%—的范圍)。

如果預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在濃度等于1000μg/mL時(shí)仍未出現(xiàn)細(xì)胞毒性,則建議高濃度為1000μg/mL;若出現(xiàn)細(xì)胞毒性的濃度低于1000μg/mL時(shí),有細(xì)胞毒性的濃度少于三種,則需要進(jìn)行重復(fù)試驗(yàn)或使用更小的稀釋因子,直至出現(xiàn)有細(xì)胞毒性的濃度至少三種。如果根據(jù)受試物的溶解度,高濃度不能達(dá)到1000μg/mL,則以大溶解度時(shí)的濃度作為高濃度,避免受試物在任何濃度出現(xiàn)沉淀。

如果在無光照條件下(-Irr)受試物在高濃度時(shí)仍然不具有細(xì)胞毒性,而在有光照條件下(+Irr)出現(xiàn)強(qiáng)烈細(xì)胞毒性,則在-Irr試驗(yàn)和+Irr試驗(yàn)中可采用不同的試驗(yàn)濃度。

(七)中性紅(Neutral Red,NR)

化學(xué)名為3-氨基一7一二甲氨基一2一甲基吩嗪鹽酸鹽(3-amino-7-dime-2-thylamino-2-methylphenazine hydrochloride),CAS編號:553-24-2;或藥品標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì),編號:100460。

(八)中性紅溶液

1.中性紅原液。稱取0.4g中性紅染料,溶于100mL蒸餾水(室溫條件下可保存2個(gè)月)

2.中性紅使用液。在79mL DMEM培養(yǎng)液中加入1mL中性紅原液,即為使用液。中性紅終濃度為50μg/mL。

(九)中性紅解吸附溶液

將蒸餾水、乙醇、乙酸按49:50:1比例配制(現(xiàn)用現(xiàn)配,儲存不超過1小時(shí))。

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